Quy trình sản xuất rễ tơ cây bá bệnh bằng bioreactor

Cây bá bệnh (Eurycoma logifolia) là cây thuốc quý của nền Đông y Việt Nam, cũng như nhiều nước trong khu vực Đông Nam Á, đã đươc sử dụng từ rất lâu đời để bồi bổ cơ thể và chữa nhiều loại bệnh khác nhau. Rễ của cây bá bệnh được cho là có dược tính cao nhất, vị đắng, tính mát, dùng để giảm sốt, chữa giun sán đường ruột, lỵ, tiêu chảy, khó tiêu, cải thiện chứng trầm cảm sau sinh,… Một công dụng khá phổ biến được nhiều người biết đến là tăng cường sinh lý ở nam giới, do nhóm hoạt chất quassinoid, tiêu biểu là eurycomanone mang lại, thông qua tác động làm tăng tiết lượng hormon testosterone trong cơ thể.

 

 

 

Thông thường, cây bá bệnh khoảng 5 tuổi trở lên bắt đầu được thu hoạch thủ công bằng cách nhổ cả cây để lấy rễ, tuy nhiên cây lâu năm hơn thì càng có nhiều dược tính và được ưa chuộng hơn. Do có nhu cầu và giá trị kinh tế cao, nên thời gian qua cây bá bệnh trong tự nhiên bị khai thác ồ ạt làm suy giảm số lượng, dẫn đến nguồn cung không ổn định. Nếu trồng mới bằng các phương pháp truyền thống, đòi hỏi phải mất nhiều chi phí, công sức để quy hoạch, cải tạo đất đai, gieo trồng và chăm sóc cây tối thiểu 5 - 6 năm mới đạt chất lượng sử dụng.

 

Nếu ứng dụng công nghệ sinh học, các phương pháp nhân sinh khối như nuôi cấy huyền phù tế bào, mô sẹo, mô sẹo sinh phôi, các loại cơ quan bao gồm chồi và rễ bất định hay rễ tơ được xem như những công nghệ nền có tính ổn định và đầy hứa hẹn cho việc sản xuất dược liệu tích lũy các hợp chất tự nhiên. Trong đó nuôi cấy rễ tơ được ghi nhận là có những đặc điểm nổi trội. Rễ tơ được tạo ra do sự cảm ứng của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes trên thực vật, có thể mang những ưu điểm như tăng trưởng liên tục trong môi trường mà không cần phải bổ sung chất điều hòa sinh trường, tạo đầy đủ các hoạt chất có từ cây mẹ với hàm lượng cao.

 

Vì vậy, quy trình tạo rễ tơ cây bá bệnh và công nghệ nhân sinh khối bằng hệ thống bioreactor sẽ giúp chủ động sản xuất ở quy mô lớn, góp phần cung cấp nguồn dược liệu đang có nhu cầu cao này, làm giảm bớt áp lực khai thác trong tự nhiên, giảm thiểu các tác động đến sinh thái môi trường.

 

 

 

 

Quả bá bệnh chín màu đỏ thẫm được sử dụng làm nguồn vật liệu vô mẫu. Trước tiên, quả được rửa với nước xà phòng loãng và tráng lại bằng nước máy nhiều lần để làm sạch bề mặt. Sau đó, chuyển vào khử trùng sơ bộ quả trong tủ cấy vô trùng bằng cồn 70% trong một phút, rồi tráng lại bằng nước cất vô trùng. Kế tiếp, ngâm quả với dung dịch Javel 6-7% NaClO pha loãng với nước ở nồng độ 60% trong bình tam giác được đậy kín bằng nút cao su trong 15 phút. Chú ý lắc đều để dung dịch tiếp xúc với bề mặt bình chứa và nắp. Sau khi khử trùng, quả được rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng và tách bỏ các phần thịt mềm bên ngoài, lớp vỏ cứng, màng bọc quanh hạt, rồi cấy phần phôi lên môi trường MS bổ sung 0,5mg/L GA3. Mỗi bình 1-2 hạt.

 

Hạt bắt đầu nảy mầm khoảng ngày thứ 6, phát triển các lá kép và lá chét. Từ ngày 35 – 42 các lá kép đầu tiên hình thành được khoảng 8 lá chét trưởng thành. Các lá chét trưởng thành này sẽ được dùng làm vật liệu chuyển gen.

 

Cắt các lá chét cho vào đĩa Petri và tạo vết thương để tăng hiệu quả biến nạp gen bằng cách dùng dao mổ hoặc kéo cắt thẳng góc với gân chính bỏ phần chóp lá và phần tiếp giáp cuống lá khoảng 1mm.

 

Cấy vi khuẩn A. rhizogenes từ một khuẩn lạc trên môi trường giữ giống NB rắn vào 50mL môi trường NB lỏng trong bình tam giác 250mL, lắc 180 vòng/phút ở 25±2oC trong tối, trong 42 - 48 giờ. Ly tâm thu sinh khối, rồi hòa lại trong môi trường 1/2 MS đến mật độ vi khuẩn tương ứng với giá trị OD600nm = 0,8. Sau đó, bổ sung thêm acetosyringone ở nồng độ 20mg/L và tiếp tục nuôi ở điều kiện như trên khoảng 30 phút.

 

Ngâm mẫu lá đã được tạo vết thương trong dịch vi khuẩn đã chuẩn bị ở bước 3 trong 20 phút, sau đó thấm khô dịch khuẩn và cấy lên môi trường 1/2 MS rắn bổ sung acetosyringone ở nồng độ 20mg/L để đồng nuôi cấy trong 3 ngày, trong tối, ở 25±2oC.

 

Sau khi gây nhiễm mô lá với vi khuẩn và đồng nuôi cấy trong 3 ngày, có thể quan sát thấy vi khuẩn mọc thành một lớp rất mờ và mỏng ở rìa mép lá. Tuy nhiên, mẫu lá vẫn phát triển khá tốt, không bị chuyển màu hay tổn thương.

 

Mẫu được rửa khuẩn bằng cách cho vào bình tam giác chứa môi trường 1/2 MS lỏng bổ sung 2 loại kháng sinh augmentin 90mg/L và cefotaxime 120mg/L. Sau đó, cấy mẫu sang môi trường 1/2 MS rắn bổ sung kháng sinh như trên để loại bỏ vi khuẩn và để mẫu hình thành rễ tơ, cấy chuyền mỗi 2 tuần. Từ 10 - 20 ngày sau cấy, mô mẫu hình thành các nốt rễ, ở mép lá hoặc trên phiến lá và phát triển thành sợi rễ, trong 2 tuần có thể kéo dài 5 -7cm. Sau thời gian này tiếp tục theo dõi thêm 15 ngày để ghi nhận toàn bộ các sợi rễ tăng trưởng liên tục. Tỉ lệ mô được cảm ứng tạo rễ là 36,51%.

 

Các sợi rễ tơ mọc kéo dài liên tục ở bước 5 được cắt với kích thước 2 - 3cm tính từ đầu rễ và cấy chuyền sang môi trường rắn cùng loại trong đĩa Petri, có bổ sung kháng sinh. Trong giai đoạn này các dòng rễ sinh trưởng mạnh hơn và có sự phân hóa rõ ràng hơn về hình thái. Sau 30 ngày chọn các dòng rễ kéo dài và phân nhánh tốt nhất.

 

Ly trích DNA của các dòng rễ tơ đã chọn. Kiểm tra sự hiện diện của các gen rolB, virC. Gen virC là gen không biến nạp vào thực vật, kết quả mẫu kiểm tra âm tính chứng tỏ nguồn mẫu sạch vi khuẩn A. rhizogenes. Gen rolB nằm trong đoạn DNA biến nạp từ vi khuẩn sang thực vật, sự hiện diện của gen rolB trong DNA của mẫu sạch vi khuẩn là dấu hiệu cho thấy đây là rễ tơ chuyển gen.

 

Các dòng rễ tơ chuyển gen, đã kiểm tra bằng PCR, được tách khỏi môi trường thạch, cân khối lượng 0,2g và cấy vào trong môi trường SH lỏng + 30g/L sucrose để định lượng mức tăng sinh khối sau 2 tuần. Đồng thời, sinh khối rễ được kiểm nghiệm để định lượng hàm lượng eurycomanone tích lũy tại Trung tâm Sâm và Dược liệu TP.HCM. Chọn lọc các dòng rễ có mức tăng sinh khối và tích lũy eurycomanone cao.

 

 

Cấy 0,3 g mẫu rễ tơ từ nguồn nuôi giữ giống sang bình tam giác chứa 75 mL môi trường, nuôi lắc 100 vòng/p, ở 25±2 oC, chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang ở cường độ 1500 lux, quang kỳ 12 giờ. Thời gian nuôi 21 ngày, lượng sinh khối nhân trong bình tam giác đạt được khoảng 12 g. Do đó, cần chuẩn bị 4 - 5 bình tam giác để đủ lượng mẫu cấy là 40 g cho 1 bioreactor 20 L chứa 10 L môi trường.

 

Chuyển bioreactor đã lắp đặt và khử trùng vào tủ cấy, khóa các ống dẫn khí silicon. Rễ tơ từ bước 1 được thu hoạch và cho vào đĩa vô trùng. Tiến hành loại bỏ các sợi rễ già, hóa nâu, nhũn. Cân 40g từ phần rễ tốt còn lại làm lượng mẫu cấy cho bioreactor.

 

Cấy lượng rễ tơ đã chọn lọc vào bioreactor, sau đó đổ nhẹ 10L môi trường đã vô trùng vào bình. Khử trùng miệng bình bằng đèn cồn. Đậy chặt nắp bình.

 

Chuyển bình bioreactor và các bộ phận kết nối lên giá đỡ. Nối đầu bộ lọc của đường ống sục khí vào ống thổi khí của máy bơm thông qua một bộ phận điều chỉnh lưu lượng khí, mở khóa ống dẫn khí. Điều chỉnh mức lưu lượng khí trong thời gian 2 tuần đầu là 0,2 vvm và 2 tuần sau là 0,4 vvm. Bioreactor được chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang ở cường độ 1500 lux, quang kỳ 12 giờ.

 

+ Cảm ứng với methyl jasmonate (MeJA):

 

Ở ngày thứ 26, khóa các ống dẫn khí, tháo bioreactor và các bộ phận đã kết nối ra khỏi hệ thống như trước đó, đưa vào tủ cấy đang hoạt động. Khử trùng miệng bình bioreactor bằng đèn cồn. Mở nắp bình, bổ sung MeJA vô trùng đạt nồng độ 22mg/L. Khử trùng miệng bình, đậy nắp lại, chuyển bình lên giá đỡ bên ngoài và kết nối lại với máy bơm khí để tiếp tục nuôi.

 

+ Kiểm tra sự nhiễm tạp và kết thúc nuôi:

 

Trong quá trình nuôi, nếu phát hiện sự nhiễm tạp trong bình nuôi cấy thông qua biểu hiện môi trường bị đục, quá trình nuôi rễ sẽ được kết thúc.

 

Sau 28 ngày, rễ được thu hoạch từ bioreactor. Sinh khối rễ được rửa 3 lần với nước sạch rồi sấy khô ở nhiệt độ 50 - 60oC đến khi khối lượng không đổi. Có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn hoặc bảo quản lạnh đông -80oC trong thời gian dài.

 

 

 

Rễ tơ được thu hoạch từ bioreactor 20L sau 4 tuần nuôi được sấy khô và chiết cao trong methanol theo phương pháp ngâm dầm kết hợp siêu âm ở 50oC (50ml/lần), ly tâm (5 phút, 5000 vòng/phút) và thu phần dịch ly trích.

Ưu điểm của công nghệ, hiệu quả kinh tế

 

Quy trình chuyển gen tạo rễ tơ bá bệnh đã tạo được hai dòng rễ tơ R1, R2 có khả năng tăng trưởng tốt nhất, dựa trên chỉ tiêu sinh khối (có độ dài tốt và phân nhánh liên tục) và tích lũy hoạt chất eurycomanone (hoạt chất chính giúp tăng tạo testosterone ở nam giới). Trong đó, dòng rễ tơ R2 cho thấy có hiệu quả sản xuất eurycomanone cao, tương đương với cây tự nhiên, được chọn để phục vụ sản xuất quy mô lớn. Quy trình nuôi rễ tơ bá bệnh trong bioreactor 20L đã tạo ra sinh khối đạt 1712,7g/bình trong 4 tuần, với hệ số nhân ổn định 42,8 lần, hàm lượng eurycomanone tích lũy trong rễ cao (1,185mg/g).

 

 

 

Chiết cao methanol từ rễ tơ dòng R2 nuôi trong bioreactor 20L đạt hiệu suất 30,20%, hàm lượng eurycomanone 3,37mg/g. Cao có thể chất đặc, cứng, bề mặt mịn, hơi dính, màu nâu đen sẫm. Mùi hương đặc trưng của bá bệnh. Vị đắng. Tan hoàn toàn trong nước. Cao không có các vi khuẩn như Coliform, Escherichia coli, Salmonella spp, Clostridium perfringens, kim loại nặng,… đạt tiêu chuẩn trong lĩnh vực thực phẩm, dược liệu và các ngành sản xuất liên quan.

 

Chi phí cho 1kg rễ tơ bá bệnh theo quy trình này khoảng 398.000 đồng tính theo các yếu tố nguyên vật liệu, năng lượng. Hiện nay giá bán rễ bá bệnh tự nhiên được một số nơi công bố khoảng 200.000 đồng/kg. Tuy nhiên chi phí cấu thành giá bán chỉ bao gồm phần lớn là công đào, hái từ nguồn hoang dại sẵn có và vận chuyển. Chất lượng rễ lại không xác định được do từ các nguồn khác nhau. Nếu tính thêm các yếu tố đất đai, nhà xưởng, phân bón, công lao động khi canh tác vườn nguyên liệu từ 4 - 6 năm, chi phí sẽ tăng nhiều lần. Trong khi đó, rễ tơ theo quy trình trên chỉ cần nuôi 4 tuần, khi tăng số lượng bioreactor, các chi phí năng lượng, nhân công và khấu hao thiết bị sẽ giảm do tận dụng được hiệu suất tối đa. Ngoài ra, khi áp dụng ở điều kiện sản xuất lớn có thể chuẩn hóa nguồn môi trường nuôi cấy và các vât liệu khác để giảm chi phí mà vẫn đảm bảo sự ổn định của sản phẩm. Để sản xuất quy mô lớn, tùy theo mục tiêu đề ra, có thể nhân lên số lượng bioreactor 20L cần sử dụng, cũng như tính toán công suất các thiết bị liên quan và công lao động dễ dàng. Như vậy, có thể thấy sản xuất rễ tơ bá bệnh bằng bioreactor là hướng ứng dụng công nghệ cao có khả năng cạnh tranh, đặc biệt là trong tương lai gần khi nguồn tài nguyên tư nhiên không còn phong phú.

 

Các sản phẩm nêu trên là kết quả của đề tài “Nghiên cứu nhân sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia) bằng bioreactor hướng đến sản xuất quy mô lớn” do Viện Sinh học Nhiệt đới chủ trì thực hiện, được Sở Khoa học và Công nghệ TP.HCM nghiệm thu trong năm 2021. Với thành công từ đề tài này, Viện Sinh học Nhiệt đới có thể mở rộng quy mô sản xuất sinh khối, giúp chủ động cung cấp nguồn dược liệu ổn định về chất lượng, mang lại nhiều tiềm năng kinh tế.

 

Hiện nhóm tác giả đang tiếp tục hợp tác với Sàn Giao dịch công nghệ Techport.vn (thuộc Trung tâm Thông tin và Thống kê Khoa học và Công nghệ – Sở KH&CN TP.HCM) để sẵn sàng chuyển giao quy trình cho các đơn vị, tổ chức có nhu cầu.

 

Điện thoại: 0918626043. Email: lptvn@yahoo.com

 

Địa chỉ: 9/621 Xa lộ Hà Nội, Linh Trung, Thủ Đức, TP.HCM. Điện thoại: 028.38978795

 

Địa chỉ: 79 Trương Định, P. Bến Thành, Q.1, TP. HCM

Điện thoại: (028) 3822 1635 - Fax: (028) 3829 1957

Email: pgdcn@cesti.gov.vn