Công nghệ chỉnh sửa hệ gen đã được ứng dụng trong nghiên cứu tạo giống cây trồng trong những năm gần đây trên thế giới. Đây là một công nghệ mới cho phép can thiệp và cải biến hệ gen của cây trồng một cách nhanh chóng, hiệu quả và đặc biệt là cây trồng được tạo ra bởi công nghệ này dễ được chấp nhận hơn đối với quan điểm về cây chuyển gen. Tuy nhiên, hiện nay việc ứng dụng công nghệ chỉnh sửa hệ gen trong tạo giống cây trồng ở Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Để có thể ứng dụng công nghệ này cho nghiên cứu tạo giống cây trồng mới tại Việt Nam, đặc biệt là tạo giống kháng virus, cần thiết phải triển khai nghiên cứu ứng dụng công nghệ này trên một loại cây trồng cụ thể để thử nghiệm hiệu quả và tính khả thi trước khi áp dụng rộng rãi trên các loại cây trồng khác nhau.
CRISPR là một hệ thống chỉnh sửa gen thế hệ mới đã được phát triển vào năm 2013. Đây là các yếu tố di truyền cung cấp cho vi khuẩn khả năng miễn dịch để bảo vệ chúng chống lại virus. Cơ chế bảo vệ bao gồm ba giai đoạn chính: thích ứng (adaptation), phiên mã (transcription) và can thiệp (interference). Ở giai đoạn thích ứng, khi DNA ngoại lai xâm nhập vào tế bào vi khuẩn, một phân đoạn DNA ngắn sẽ được chèn vào locus CRISPR của bộ gen kí chủ trong các cấu trúc lặp lại đặc biệt, được tách biệt nhau bởi các đoạn trình tự ngắn lặp lại hai chiều (short palindromic repeats), do đó chúng được gọi là CRISPR.
CRISPR/Cas đã trở thành hệ thống chỉnh sửa gen phổ biến nhất trong số các hệ thống chỉnh sửa gen đã được biết đến. Công nghệ CRISPR/Cas hiện đang phát triển nhanh chóng và mở rộng khả năng ứng dụng không chỉ trên các phân tử DNA mục tiêu mà còn trên cả các phân tử RNA mục tiêu bao gồm cả các virus RNA. Hệ thống CRISPR/Cas9 đã được phát triển trở thành một công cụ phổ biến cho việc chỉnh sửa gen do tính hiệu quả, đơn giản và khả dụng của nó. Nhiều nghiên cứu ứng dụng hệ thống CRISPR/Cas9 trong việc kiểm soát virus gây bệnh trên cây trồng đã được triển khai. Có tổng số 10 loài virus gây bệnh phổ biến trên cây trồng đã trở thành đối tượng của các nghiên cứu tạo tính kháng virus cho cây bằng công nghệ chỉnh sửa gen dựa trên hệ thống CRISPR/Cas9, trong đó có 4 loài thuộc họ Potyviridae và 6 loài thuộc họ Geminiviridae.
Dưa leo là một loại cây rau được trồng phổ biến và lâu đời ở Việt Nam. Dưa leo được sử dụng thông dụng trong đời sống với nhiều mục đích khác nhau. Việc trồng dưa leo xuất khẩu đã mang lại nguồn thu lớn cho người nông dân. Trung bình mỗi ha trồng dưa leo có thể mang về lợi nhuận từ 40 - 50 triệu đồng/vụ, tương ứng với 160 - 250 triệu đồng/năm (mỗi năm trồng 4 - 5 vụ). Có thể nói dưa leo là một trong những cây trồng mang lại giá trị kinh tế cao và phù hợp với chủ trương chuyển đổi cơ cấu cây trồng theo hướng nông nghiệp đô thị, tập trung vào đối tượng hoa kiểng và rau an toàn của Thành phố Hồ Chí Minh.
Một trong những khó khăn trong sản xuất dưa leo là vấn đề cây dưa leo rất dễ bị nhiễm bệnh do virus gây ra. Các loại virus gây bệnh trên dưa leo như Cucumber mosaic virus, Cucumber vein yellowing virus, Zucchini yellow mosaic virus và Papaya ringspot virus hiện đang là đối tượng được quan tâm nghiên cứu cho mục đích tạo ra giống dưa leo có khả năng kháng virus.
Đề tài nêu trên được thực hiện với mục tiêu xây dựng thành công quy trình chỉnh sửa gen trên cây dưa leo phục vụ cho công tác tạo giống dưa leo có khả năng kháng virus CVYV (Cucumber vein yellowing virus) hoặc/và CMV (Cucumber mosaic virus).
Nhóm nghiên cứu đã tiến hành thiết kế vector chỉnh sửa gen eIF4E dựa trên công nghệ CRISPR/Cas9; tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) mang vector chỉnh sửa gen; xây dựng quy trình chuyển gen vào cây dưa leo bằng vi khuẩn A. tumefaciens; tạo một số dòng dưa leo có gen eIF4E được chỉnh sửa phục vụ cho đánh giá khả năng kháng virus.
Theo đó, công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 lần đầu tiên đã được áp dụng thành công cho việc chỉnh sửa gen trên cây dưa leo ở Việt Nam, với các kết quả cụ thể như sau:
+ Vector chỉnh sửa gen eIF4E đã được thiết kế và biến nạp thành công vào chủng vi khuẩn A. tumefanciens LBA4404.
+ Xây dựng được quy trình tái sinh cho cây dưa leo với các điều kiện cụ thể: dung dịch Javel ở nồng độ 40% và thời gian khử trùng 15 phút thích hợp cho việc khử trùng mẫu hạt dưa leo để tạo nguồn mẫu phục vụ cho chuyển gen; môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L BA kết hợp với 1,0 mg/L NAA thích hợp cho sự tạo mô sẹo từ mô lá in vitro; môi trường MS bổ sung 2,0 mg/L BA, 0,25 mg/L NAA và 0,2 mg/L eatin thích hợp cho sự tái sinh chồi từ mô sẹo; môi trường MS bổ sung 1 mg/L BA thích hợp cho sự tái sinh chồi từ mô lá mầm 3 ngày tuổi; môi trường MS bổ sung 0,1 mg/L BA thích hợp cho sự tăng trưởng chồi và môi trường MS không chứa chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự tạo rễ đối với chồi cây dưa leo.
+ Xây dựng được quy trình chuyển gen vào mô lá mầm dưa qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA4404 với các điều kiện cụ thể: chất cảm ứng AS ở nồng độ 100µM và thời gian đồng nuôi cấy 4 ngày thích hợp cho việc chuyển gen; cefotaxim 500 mg/L thích hợp cho việc khử khuẩn sau thời gian đồng nuôi cấy; hygromycin ở nồng độ 10 mg/L thích hợp cho việc sàng lọc mô lá chuyển gen.
+ Chuyển thành công cấu trúc chỉnh sửa gen vào lá mầm dưa leo với hiệu quả chuyển gen đạt 0,079%.
+ Phân lập được phân đoạn gen eIF4E (708 bp) từ cây dưa leo với sự tương đồng 94% so với các trình tự tương ứng đã công bố trên ngân hàng gen.
+ Xây dựng thành công quy trình chỉnh sửa gen trên cây dưa leo và đã chứng minh được có sự thay đổi trình tự xảy ra quanh vị trí vùng trình tự mục tiêu (vị trí bắt cặp của gRNA) ở 5 dòng dưa leo so với đối chứng không chỉnh sửa gen.
+ Thực hiện thành công việc lây nhiễm virus nhân tạo và kiểm tra tính kháng virus trên các cây dưa leo mang cấu trúc chỉnh sửa gen, kết quả cho thấy tính kháng virus chưa biểu hiện rõ.
Kết quả của đề tài góp phần ứng dụng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 vào nghiên cứu tạo giống cây trồng mới tại Việt Nam, đặc biệt là tạo giống kháng virus. Quy trình chỉnh sửa gen eIF4E trên cây dưa leo được xây dựng bao gồm các bước cụ thể, có thể áp dụng cho nghiên cứu và giảng dạy, đồng thời là tiền đề cho các nghiên cứu tạo ra giống dưa leo có khả năng kháng virus phục vụ sản xuất.
Có thể tìm đọc toàn văn Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài tại Trung tâm Thông tin và Thống kê Khoa học và Công nghệ (CESTI).
Lam Vân (CESTI)